胃是一个肌肉器官，在食物储存和消化中起着重要作用。人的胃包含两个主要区域:包含胃底（fundic）上皮的胃体（corpus）和胃窦（antrum）。每一个区域都具有不同的细胞类型和功能，因此都可以作为独特的发育和疾病研究对象。

人源胃类器官（hGOs）的培养像传统的2D细胞培养一样，可以进行传代、冷冻和复苏；并且在长期保持基因组稳定性的同时，可以保留原始组织的特征。因此，构建胃类器官可以回答从基础科学到临床转化的各种问题。我们可以利用这一工具，模拟体内的器官发育、也可以用于研究幽门螺旋杆菌感染机制。此外，利用CRISPR/Cas9技术已经成功实现类器官的疾病建模，人类正在使用这一模型，揭开胃部疾病的神秘面纱。

体外3D培养胃类器官的步骤比较复杂，小编在这里整理hPSCs来源的细胞分离及胃类器官培养、扩增的步骤，改编自BRODA等人描述的方法^【1】。

图1. 人胃的结构，以及由胃底（fundic）和胃窦（antrum）构成的类器官hFGOs和hAGOs^【2】

所需试剂：

表1. hGOs培养所需的培养基

hPSCs细胞消化并传代

1.将hPSCs培养至融合度约为75–85%，且大部分无分化的状态时，吸出培养基。

2.向每个孔中加入1 ml Accutase，并将培养皿放回37℃，5% CO₂的组织培养箱中，直到所有的细胞都以小细胞块或单细胞的形式解离并漂浮(通常需要7-10分钟)。

3.向每个孔中加入5ml的DMEM/F12，以充分稀释Accutase。

4.将所有细胞转移至离心管中，室温下300g离心3min。

5.吸出上清，并进行细胞计数，同时在24孔板的每孔滴加500 μl冷的Matrigel，室温下静置使其凝固。

6.以300,000 ± 50,000个细胞/孔的数量接种在已包被Matrigel的24孔板中，每孔加入500μl mTeSR1（含有10 μM ROCK inhibitor Y-27632）。

7.将24孔板放置在37℃，5% CO₂的组织培养箱中孵育24h。

8.在显微镜下观察状态，当单层的hPSCs融合度达到75-90%时，记为第0天。

hPSCs分化为人DE（第0-2天）

9.吸出mTeSR1培养基，加入DE生成培养基继续培养48h，每24h换液一次（按照表格中的时间节点进行配制）。在分化过程的第一天和第二天，可以观察到大量漂浮的细胞碎片，但仍具有连接细胞的网状结构。

10.分化第二天后，单层细胞融合度可以达到95–100%。

后前肠球状体的自发出芽（第3-5天）

11.吸出培养基，加入球状体生成培养基继续培养48h，每24h换液一次（按照表格中的时间节点进行配制）。

12.在第4天可以看到在孔表面有明显的球体生成前的3D结构。

13.由于第5天的培养基中有添加RA，因此需要关闭生物安全柜的灯，并用锡箔纸包裹培养基和RA管，以防止过度曝光。此时可以观察到有大量出芽结构的3D球体，和少量漂浮的球状细胞团。

14.第6天，可以观察到培养基中漂浮着大量的后前肠球状体。

15.在显微镜下小心地吸出后前肠球状体，并收集到微量离心管中。

球状体发育成hAGOs或hFGOs(第6-20天)

16.在4℃条件下过夜解冻Matrigel。

17.将装有后前肠球状体的微量离心管直立放置在管架上约5min，利用重力将球状体沉降在底部，此时不需要离心。

18.尽可能多地去除上层培养基，将350 μl冷的Matrigel快速加入到含有球状体的微量离心管中，快速吹打混匀，注意避免引入气泡。

19.吸取50 μl悬浮液，接种到24孔板的孔中心。保持移液器吸头稍微高出孔底，并确保移液时不会接触孔壁。

20.将培养皿放入组织培养箱中孵育10-15min，使Matrigel完全固化。然后向每个孔中添加500 μl hGOs形成培养基，确保每个孔中的Matrigel都被培养基覆盖。

21.当培养基中的酚红变黄，或当培养方案要求改变生长因子时（以先发生者为准），每4天更换一次 hGOs形成培养基，直到第20天。

hGOs传代以实现持续增长

22.在第20天左右，通过将hGOs重新包埋在新鲜的Matrigel中，来降低每个孔中hGOs的密度。

23.在显微镜下观察肺类器官，为了确保最佳生长状态，每个孔应包含约 500 个类器官。

24.吸出孔内的培养基，加入少量DMEM/F12培养基。

25.在立体显微镜下，使用解剖刀将嵌入hGOs的Matrigel切割成薄片，每个切片包含五到十个hGOs。尽量避免直接切割hGOs，而是切割周围的Matrigel，当然大多数被切割的hGOs会重新形成完整的内腔并继续生长。

26.重复步骤16-21进行hGOs传代培养。

成功培养出的hGOs可以作为研究胃生理学、胃疾病生理学和药物开发的有力模型。

类器官作为一种研究模型，在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等方面潜力巨大。但是，类器官培养技术建立过程中会面临多种挑战。为了更轻松更高效的建立类器官培养技术，欢迎各位扫码加入类器官培养交流群，在这里会有专业的技术支持人员帮您解惑答疑，也将定期分享类器官前沿进展，让类器官培养更简单！

类器官培养交流群

推荐产品-胃类器官培养

相关产品：

参考文献

【1】BRODA, Taylor R.; MCCRACKEN, Kyle W.; WELLS, James M. Generation of human antral and fundic gastric organoids from pluripotent stem cells. Nature protocols, 2019, 14.1: 28-50.

【2】 SEIDLITZ, Therese; KOO, Bon-Kyoung; STANGE, Daniel E. Gastric organoids—an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation, 2021, 28.1: 68-83.

苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，是一家专注于重组蛋白应用解决方案的高新技术企业，主营业务为靶点及细胞因子类蛋白、重组抗体、酶及试剂的研发、生产和销售，并提供相关技术服务。公司定位为医疗健康与生命科学领域原料与技术解决方案的上游供应商，致力于为下游客户提供及时、稳定、优质的产品及服务，助力全球生物医药企业和研究机构的技术与产品创新升级。

详询www.novoprotein.com.cn或致电400-600-0940。