当细胞中需要表达一个以上的基因时，可以使用双反子或多顺反子表达载体。在构建双顺反子或多顺反子载体的各种策略中，来源于脑心肌炎病毒EMCV的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)或来源于口蹄疫病毒FMCV的自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide，2A)被广泛应用，实现了在单个载体上同时表达多个基因的目的。
01 内部核糖体进入位点IRES IRES能够在一些反式作用因子的辅助下，招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始位点，使蛋白质翻译起始不依赖于5′帽结构，从而使核糖体直接从mRNA中间起始翻译成为可能，即允许在同一启动子的控制下共同表达多个基因。 02 自剪切多肽2A 自剪切多肽2A于1991年在口蹄疫病毒（FMDV）中被发现，平均长度为18-22个氨基酸，位于小核糖核酸病毒家族成员的两种蛋白质之间。2A肽的切割位点一般位于其C末端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间。自切割后，2A肽N末端的氨基酸残基连接到上游蛋白，脯氨酸残基则依然连接在下游蛋白，通常2A肽残基可以通过弗林蛋白酶和信号肽去除。 2A肽的自裂解机制 （Wang Y et al. Sci Rep, 2015） 目前，主要有4种常用的2A肽，分别来源于口蹄疫病毒2A(F2A)、1型猪捷申病毒2A (P2A)、明脉扁刺蛾病毒2A (T2A)、马甲型鼻炎病毒2A (E2A)，对应的序列如下： IRES和P2A的选择
F2A:VKQTLNFDLLKLAGCVESNPG
P2A:GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
T2A:EGRGSLLTCGDVEENPG
E2A:QCTNYALLKLAGDVESNPG
