ACROBiosystems百普赛斯Star Staining新一代定点标记技术平台开发的高质量荧光标记蛋白，可保持蛋白的天然构象，不影响蛋白活性，均一性好、批间一致性高。“星级”的研发实力，“星级”的技术平台及产品，Star Staining专为CAR-T细胞质控和临床样本分析检测而设计。
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嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫治疗是一种新型的细胞免疫疗法，其主要通过基因编辑技术使T细胞表达嵌合抗原受体(CAR)从而特异性识别并杀伤表达相应抗原的靶细胞进而治疗疾病[1]。CAR的成功表达及靶抗原结合活性是CAR-T治疗成功的先决条件，荧光标记靶点蛋白因简单高效的流式检测流程及避免了因使用二抗而产生的非特异背景，成为CAR表达检测的关键原料，这对CAR-T细胞治疗药物的产品质控至关重要。然而高质量荧光标记蛋白的生产面临着诸多难题，如标记后蛋白活性难以维持、产品的批间一致性难以控制等问题，目前市场上少有高质量的荧光标记蛋白产品可供选择，实际上，这与荧光染料本身特性、以及使用的荧光标记技术密切相关。
图1 荧光素类标记试剂的主要结构(左)和FITC的分子结构(右)
藻红蛋白（phycoerythrin，PE）从红藻中分离纯化获得的一种常见染料，经激光激发后发出橙黄色荧光，最大发射波长为575 nm，PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点。在流式细胞术检测中，PE标记的蛋白适用于所有配备488/561nm氩离子激光器的流式细胞仪。水溶性好：通过亲水性磺酸基的引入，提高荧光染料的水溶性，且储存不易产生沉淀；
发射光谱窄：相较于传统有机荧光染料，Alexa Fluor染料具有较窄的发射光谱，从而降低多荧光检测的交叉串色。
抗淬灭、荧光强度强：光稳定性好，相关研究显示，将Alexa Fluor和AMCA、 Lucifer Yellow、荧光素、罗丹明6G和Cy3 等荧光标记蛋白的信号强度对比分析发现，尽管这些染料具有与Alexa Fluor染料类似的发射和激发光谱，但在各染料的吸收和发射光谱范围内Alexa Fluor染料量子产率更高、荧光强度更强、光稳定性更好（图2）[3]，尤其适用荧光成像的应用场景。
非pH敏感：Panchuk-Voloshina[3]等对Alexa Fluor染料的发射光谱、吸收光谱和荧光信号强度进行研究时，证明Alexa Fluor染料对pH的变化不敏感，可在 pH为4-10下保持稳定结构和强荧光信号。
接下来，一起来看几种常见的Alexa Fluor染料分子吧~
1）Alexa Fluor 488：Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致，经激光激发后发出绿色荧光，最大发射波长为519 nm，但其荧光强度和稳定性要优于FITC，且在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。
2）Alexa Fluor 555：Alexa Fluor 555的荧光光谱和Cy3非常接近，最大发射波长为565nm,荧光更强，稳定性更好，可耐受更长的荧光信号捕捉时间。
3）Alexa Fluor 647：Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料，其最大发射波长为668 nm，一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有荧光量子产率高、光稳定性好、pH耐受范围广和荧光不易淬灭等特点，是APC和Cy5的优质替代品。
蛋白质荧光染料因其检测灵敏度高及可视化的独特优势，日益广泛地应用于生物分析，蛋白质组的识别和各项生理标检测等领域，荧光标记靶点蛋白也已成为生物医药行业，如细胞治疗药物开发过程中的关键检测原料。因此，搭建通用性的蛋白质荧光定点偶联技术平台及开发不同荧光染料的定点标记技术，是满足当前市场对荧光标记类蛋白产品日益增长的质量要求和多样化需求的必经之路。
为满足细胞治疗产品质控和临床样本分析更高质量标准的检测要求，填补蛋白质定点荧光标记产品的市场空白，ACROBiosystems在多年技术经验积累的基础上，不断更新完善，以“星级”研发实力，成功搭建了“星级标准”的Star Staining新一代荧光定点标记技术平台，与传统非定点蛋白质标记相比，Star Staining定点标记技术可大程度的维持蛋白的天然构象和活性，并保证标记产品性能的高度均一性和批间一致性。
依托Star Staining定点标记技术平台，ACROBiosystems开发了一系列独具特色的Star Staining系列荧光定点标记蛋白产品，包括Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 647、FITC、APC、PE等多种荧光类型，覆盖CD19，BCMA，GPC3，MSLN，CD22，CD33，CD7，CD5等热门CART靶点蛋白，助力细胞治疗药物的研发进程。
“星级”技术平台
蛋白特定位点标记
标记位点远离活性中心，维持蛋白天然空间构象
高效生物正交反应，无非特异信号
产物均一性好、批间一致性高
“星级”产品特色
采用定点标记技术，不影响蛋白天然构象，高蛋白活性
高灵敏度和高特异性，经类CAR细胞批检验证
高度均一，极低非特异信号，经PBMC双染批检放行
高批间一致性，高水平满足临床样本分析检测要求
高稳定性（经加速、冻融验证）
荧光类型丰富（FITC\PE\APC\Alexa Fluor 488\555\647）
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验证数据
>>>明星产品——Alexa Fluor 555-Labeled Human BCMA Protein, His Tag Star Staining（Cat. No. BCA-HA2H6)
Anti-BCMA CAR-293 cells were stained with Alexa Fluor 555-Labeled Human BCMA Protein (Cat. No. BCA-HA2H6) and negative control protein respectively, Alexa Fluor 555 signal was used to evaluate the binding activity.
>>>明星产品——PE-Labeled Human Siglec-2 / CD22 Protein, His Tag Star Staining（Cat. No. SI2-HP2H5）
5e5 of anti-CD22 CAR-293 cells were stained with 100 μL of 1:50 dilution (2 μL stock solution in 100 μL FACS buffer) PE-Labeled Human Siglec-2, His Tag (Cat. No. SI2-HP2H5) and negative control protein respectively (Fig. C and B), and non-transfected 293 cells were used as a control (Fig. A). PE signal was used to evaluate the binding activity.
5e5 of PBMCs were stained with PE-Labeled Human Siglec-2, His Tag (Cat. No. SI2-HP2H5) and anti-CD3 antibody, washed and then analyzed with FACS. FITC signal was used to evaluate the expression of CD3+ T cells in PBMCs, and PE signal was used to evaluate the non-specific binding activity to PBMCs.
>>>明星产品——APC-Labeled Human CD19 Protein, His Tag star staining（Cat. No. CD9-HA2H9）
Anti-CD19 CAR-293 cells were stained with APC-Labeled Human CD19 (20-291) Protein (Cat. No. CD9-HA2H9) and negative control protein respectively, APC signal was used to evaluate the binding activity.
>>>高批间一致性
不同荧光标记产品的不同批次蛋白活性可保持一致，具有高批间一致性，以确保长期用于CAR-T细胞质控和临床样本分析中检测结果的稳定性和可靠性。
Binding activity of different lots of FITC-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HF2H3), AF555-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HA2H6) and PE-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HP2H7) against anti-BCMA CAR-293 cells was evaluated by flow cytometry. The result shows very high batch-to-batch consistency.
>>>高稳定性
25℃条件下加速48h和反复冻融三次，依然可保持较高的生物活性，显示出蛋白的高度稳定性，可放心储存和使用。
PE-Labeled Human BCMA (Cat. No. BCA-HP2H7) and FITC-Labeled Human BCMA (Cat. No.BCA-HF2H3) at 25℃ for 48 hours and freeze-throw cycles are stable without performance reduction.
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参考文献
[1] Yonghong Li, Yan Huo, Lei Yu, Junzhi Wang, Quality Control and Nonclinical Research on CAR-T Cell Products: General Principles and Key Issues.https://doi.org/10.1016/j.eng.2018.12.003.
[2] 王洪苏, 关桂静, 刘金香. Alexa Fluor荧光标记在细胞学和分子生物学研究中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(9):71-71.
[3] Panchuk-Voloshina N, Haugland RP, Bishop-Stewart J, et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 1999;47(9):1179-1188. doi:10.1177/002215549904700910
[4] Dean KM, Palmer AE. Advances in fluorescence labeling strategies for dynamic cellular imaging. Nat Chem Biol. 2014;10(7):512-523. doi:10.1038/nchembio.1556