对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法（FACS）检测CAR转染阳性率。目前，针对CAR不同结构区域的检测方法，包括针对CAR抗原结合位点的，比如CD19抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体、Protein L蛋白。➞文末可下载细胞治疗质量控制相关指导原则和政策解读相关文件哦~
那么，如何选择合适的CAR表达检测试剂呢？接下来，小编结合各种检测试剂的检测原理和优缺点，帮您选择出最合适的CAR表达检测试剂~
通用型CAR检测试剂
>> 抗Fab抗体
抗 Fab 抗体可识别抗体Fab段，可与含有Fab段可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的（图1），具有一定的通用性，可检测不同靶点的CAR。商品化的抗 Fab 抗体产品质量参差不齐且多数为多抗，批间一致性较差。来自 Jackson ImmunoResearch Laboratories 的多克隆山羊抗小鼠 F(ab)2 抗体是目前使用最广泛的抗Fab抗体，曾用于上市药物Yescarta 的抗 CD19 CAR表达检测[1]。
图1 抗 Fab 抗体和protein L的CAR检测结合位点
要点：
-
染色前后需要严格洗涤，否则会与非 CAR的 IgG 样蛋白交叉反应而出现严重非特异；
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做多色染色时，与其他抗体或FcX封闭试剂不兼容；
-
不能对双靶点CAR细胞上的单独CAR分别染色；
-
不能对合成的CAR进行检测。
靶抗原蛋白
要点
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可与CAR特异性结合，具有CAR功能性验证作用；
-
可检测双靶点CAR-T细胞中单CAR的表达；
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荧光标记的靶抗原蛋白，可一步染色完成检测CAR表达，减少非特异背景并节约时间；
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还可用于激活 CAR-T 细胞；
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价格相对Protein L等通用型检测试剂较贵。
抗独特型抗体
要点
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特异性结合CAR的scFv；
-
高特异性和高灵敏度，且非特异背景低，适用于检测临床样本；
-
具有中和活性的抗独特型抗体，可检测到游离的CAR阳性T细胞；
-
具有靶点专属性，开发周期长；
图2 靶点蛋白和抗独特型抗体分别检测CAR阳性率的原理
总结
总体来看，Protein L、抗Fab抗体、靶抗原蛋白以及抗独特型抗体作为CAR表达检测试剂均有各自的优缺点，结合实际的应用情况，有以下几点建议供参考：
-
尽量不使用Protein L或抗Fab抗体，避免高非特异，导致实验结果不易分析；
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抗体筛选、方法开发、质控等阶段建议选用抗原蛋白，保证筛选到的scFv具有功能性作用和质控方法的稳定性；
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对于后期临床阶段来说，抗原蛋白为首选，来确保临床PK等药效学研究结果的可靠性，但对于临床样本，存在细胞组分比较复杂、CAR-T细胞含量较低等问题，导致CAR检测难度加大，因此，可选择灵敏度较高的抗独特型抗体检测临床样本。
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验证数据
> PE标记CD19蛋白
可一步染色完成CD19 CAR表达检测
> PE标记CD19蛋白
与未转染CAR的PBMC样本无结合
> 抗FMC63抗体
经FACS验证，可高灵敏检测CD19 CAR表达
> 抗FMC63抗体
经ELISA验证，具有中和活性，IC50 为0.084 μg/mL
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参考文献：
[1] Kochenderfer JN, Feldman SA, Zhao Y, Xu H, Black MA, Morgan RA, et al. Construction and preclinical evaluation of an anti-CD19 chimeric antigen receptor. J Immunother. (2009) 32:689–702.
[2] Jena B, Maiti S, Huls H, Singh H, Lee DA, Champlin RE, et al. Chimeric antigen receptor (CAR)-specific monoclonal antibody to detect CD19-specific T cells in clinical trials. PLoS ONE. (2013) 8:e57838.
[3] Gomes-Silva D, Mukherjee M, Srinivasan M, Krenciute G, Dakhova O, Zheng Y, et al. Tonic 4-1BB costimulation in chimeric antigen receptors impedes T cell survival and is vector-dependent. Cell Rep. (2017) 21:17–26.
[4] Hu Y, Huang J. The Chimeric Antigen Receptor Detection Toolkit. Front Immunol. 2020;11:1770. Published 2020 Aug 11.
[5] https://ishare.ifeng.com/c/s/7xXSe4KmgTS
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