蛋白磷酸化修饰具有快速、高效和动态变化的特点，其能够将环境变化和细胞信息关联起来，从而调控生物学过程。然而，一个刺激或扰动往往引发的成百上千甚至上万磷酸化位点变化，如何从中识别出能够发挥功能的磷酸化位点是一个极具挑战的工作。 2021年12月，来自悉尼大学David E. James、Sean J. Humphrey等团队，在Nature Biotechnology（IF 54.908）上共同研究发表了“Personalized phosphoproteomics identifies functional signaling”论文，提出了一种“个体化磷酸化蛋白质组学”思路，通过将实验和计算分析的结合，找到对行为变化及其生物表型背后贡献最大的磷酸化蛋白及位点。研究以锻炼后胰岛素信号、糖摄入的生理变化为例，利用DDA、DIA磷酸化组学分别用于发现与验证队列，全面证明了“个体化磷酸化组学”思路作为通用分析策略，可以揭示复杂生物学过程背后的关键信号转导途径。 研究材料 发现队列：5位受试者20例骨骼肌活检 验证队列：10位受试者40例骨骼肌活检 技术路线 步骤1：“个体化磷酸化组”分析流程的建立与实验设计； 步骤2：发现队列：DDA磷酸化蛋白质组发现个体磷酸化呈现特异性特征； 步骤3：个体化磷酸化蛋白质组定义了人群中“不变”与“可变”磷酸化位点； 步骤4：运动重构了人骨骼肌中的胰岛素信号； 步骤5：个体化磷酸化蛋白质组学分析优先展示与表型相关的功能性信号通路； 步骤6：验证队列：DIA磷酸化组分析确证个体化磷酸化蛋白质组分析结果。 研究结果 1. “个体化磷酸化组”分析流程的建立与实验设计 经典的磷酸化组学数据分析倾向比较不同处理组间取均值后的差异，这样仅能发现给定样本规模中显著变化的磷酸化差异。本研究则建立了一个“个体化磷酸化组”分析，在行为干预前后对个体独立进行纵向磷酸化蛋白质组采样与表型记录，从而找到对行为变化及其生物表型背后贡献最大的磷酸化蛋白及位点。 为验证该思路，本研究通过分析锻炼引发的胰岛敏感性及其糖代谢表型变化背后的磷酸化，找到了与之最紧密关联的磷酸化位点。实验设计了DDA磷酸化组分析的发现队列、DIA磷酸化组分析的验证队列。发现队列中：选取5个受试者进行2.5h单腿伸膝运动，随后对运动和休息的俩腿肌肉分别活检取样，然后进行2h高胰岛素正糖钳夹术方法评价胰岛素敏感性和血糖测定，术后再次活检取样。
图1 个体化磷酸化组分析流程的建立与实验设计
2. 发现队列：DDA磷酸化蛋白质组发现个体呈现特异性特征
实验对共计20例活检样本进行磷酸化组、蛋白质组分析，共定量到2776个蛋白上超过11000差异磷酸化位点。通过对全部磷酸化数据进行聚类和PCA，发现同一受试者的磷酸化蛋白质组聚集最紧密，表明不同个体的相同组织的基态磷酸蛋白质组呈现独特的个体化特征。
图2 磷酸化蛋白质组呈现个体特异性的变化特征
3. 个体化磷酸化蛋白质组定义了人群中“不变”与“可变”磷酸化位点
人群磷酸化蛋白质组变异往往由一系列磷酸化变化驱动。本研究进一步将受试间最大变异系数（CV）≤ 15%的磷酸化位点定义为“不变磷酸化位点”，而任何受试者间变异系数（CV）> 75%的磷酸化位点定义为“可变磷酸化位点”。分析表明，“不变磷酸化位点”富集在细胞周期、细胞凋亡相关蛋白中。“可变磷酸化位点”则具有磷酸化独特变化，比如ERK2（T185）发生显著变化，该位点在不同受试者之间变化 90 倍，同时在基态与胰岛素注射间变化8倍，表明该位点呈现高度动态变化。
图3 个体化磷酸化蛋白质组定义了人群中“不变“与”可变“磷酸化位点
4. 运动重构了人骨骼肌中的胰岛素信号
进一步对同一受试者不同条件下的个体磷酸化变化进行分析，并将变化磷酸化位点及蛋白整合成为与胰岛素信号密切相关的通路图，其中绿色标注蛋白为KEGG、GO等收录的胰岛素信号相关经典通路蛋白，紫色标注蛋白则为未报道过的非经典胰岛素信号相关蛋白。分析发现胰岛素激活激酶（如AKT）是整个调控网络的核心，其信号转导至更远端蛋白质以调节关键功能，包括参与合成（RPS6、EIF4EBP1、EIF4EBP2）、转录（MAF1）、糖酵解（PFKFB2）和 GLUT4转位等远端蛋白，而且大部分胰岛素调控磷酸化蛋白并非报道的经典相关蛋白。
图4 运动重构了人骨骼肌中的胰岛素信号
5. 个体化磷酸化蛋白质组学分析优先展示与表型相关的功能性信号通路
为找到与葡萄糖摄入紧密相关的目标磷酸化，在磷酸化位点与表型之间建立了严格的配对相关标准（Padj < 0.05），从1437条磷酸化肽段中，筛选到了与葡萄糖摄入显著相关的132条磷酸化肽段。个体化磷酸化蛋白组分析中，筛选的磷酸化位点显示功能富集程度是所有差异磷酸化的2.6倍。报道的功能位点的百分占比显著大于测试位点的随机排列样本。
图5 个体化磷酸化蛋白质组学分析优先展示与表型相关的功能性信号通路
6. 验证队列：采用DIA磷酸化组分析确证个体化磷酸化蛋白质组分析结果
为了测试个性化磷酸化组分析结果的可重复性，设计了验证队列：采集10名新受试者不同状态下共计40例活检样本进行DIA磷酸化蛋白质组分析，定量到23174条磷酸化肽段，在验证队列中同样找到的与葡萄糖摄入相关磷酸化位点中，98%变化一致，75% 显著相关。此外，在发现队列找到的8条相关通路中，包括葡萄糖代谢过程、胰岛素刺激、糖原生物合成和 TOR 信号等6条均被验证到。总之，该验证实验重复了与葡萄糖摄取相关的功能富集结果。
图6 DIA磷酸化组分析确证个体化磷酸化蛋白质组分析结果
小结
本研究建立了一个“个体化磷酸化组”分析流程，利用个体表型变异，通过结合实验和计算分析出与生物学功能联系最紧密的蛋白磷酸化。利用实验利用这个方法，分别采用DDA及DIA模式的磷酸化组分析，作为发现与验证队列，探索了锻炼是如何增强人骨骼肌中的胰岛素信号，以及其背后关键的磷酸化位点，包括在糖代谢中一些蛋白上已知和未知的磷酸化位点等。综上，这些结果确立了“个性化磷酸化蛋白质组学”作为发现复杂生物学变化背后关键信号转导途径的通用方法。
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