蛋白质印迹的二抗选择指南
目标物种（一抗）
在选择用于蛋白质印迹的二抗时，主要选择标准之一是二抗所结合的一抗的物种。例如，如果一抗是兔多克隆IgG，则可以使用在另一个宿主物种（例如山羊、驴或小鼠）中产生的抗兔IgG二抗来检测一抗（例如，山羊抗兔IgG二抗Ab176443）。
为了通过蛋白质印迹检测多个特定蛋白质靶标，使用来自不同物种的一抗会很有帮助。然后可以使用标记有不同荧光染料（例如 Alexa Fluor Plus 488、555、647或680）的匹配二抗进行多重荧光蛋白质印迹。
我们提供多种标记二抗，适用于荧光或化学发光蛋白质印迹。从超过15种目标物种中选择，找到与您的一抗相匹配的新二抗。
我们可以生成二抗以结合整个一抗免疫球蛋白，例如H+L（重链和轻链）靶向二抗，或者可以生成二抗以仅结合免疫球蛋白的特定部分，例如kappa与lambda 轻链特异性二抗、重链与轻链特异性二抗或片段特异性二抗。例如Fc片段特异性二抗、F(ab) 或 F(ab')2 特异性二抗。
在规划蛋白质印迹实验时，除了优化抗体稀释度等其他因素外，二抗的选择也有助于获得最佳结果。精心选择二抗并优化稀释度可以显著改善蛋白质印迹分析，尤其是在处理同一蛋白质印迹膜上不同丰度的蛋白质靶标或高亲和力与低亲和力的一抗时。
靶标丰度变化非常常见，因为上样对照管家蛋白在裂解物中非常丰富，而许多目标蛋白靶标可能仅以低拷贝数表达。在同一膜上同时可视化两者可能具有挑战性。下表提供了一般准则，可帮助利用不同二抗的独特功能来改善蛋白质印迹检测。
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二抗靶点 |
优点缺点 |
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H+L链特异性：多种二抗与一抗的重链和所有免疫球蛋白的轻链结合 |
优点： （1）最通用的选择。抗体可与重链和轻链结合，而不受一抗结构影响。 （2）推荐用于化学发光和荧光蛋白质印迹法中蛋白质靶标的高信号放大。 （3）利用交叉吸附或高度交叉吸附的抗体获得高灵敏度和低背景。 缺点： （1）高丰度靶标检测可能导致高抗体浓度下线性检测范围之外的信号饱和。 （2）建议使用交叉吸附或高度交叉吸附的H+L二抗，以最大限度地减少与样品中IgG结合蛋白的交叉反应。 （3）可能与其他免疫球蛋白的轻链发生交叉反应。例如，所有山羊抗兔 IgG（H+L）二抗不仅会与兔IgG重链（γ链）结合，还会与所有兔免疫球蛋白（如IgM、IgE 或IgA）的轻链结合。 |
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Fc片段特异性：二抗与重链的 Fc 部分结合 |
优点： （1）是检测小鼠单克隆一抗的良好选择，结合不依赖于轻链特异性。 （2）当一抗靶标在~25 kD处时，可在免疫沉淀后用于结合天然一抗IgG。Fc特异性二抗仅检测变性IgG的50 kD重链，而不结合25 kD轻链。 （3）可用于检测重链Fc部分不同的特定免疫球蛋白同型和亚类。此特性使得使用不同同型和亚类的一抗在荧光 WB中进行多重检测成为可能。 （4）Fc片段特异性二抗用途广泛，因为它们也可用作免疫测定中的捕获或检测抗体。 缺点： （1）通常比H+L特异性二抗灵敏度更低。 （2）免疫细胞样本中的Fc受体可能造成干扰。 （3）在免疫沉淀后使用时，Fc特异性二抗会结合天然一抗IgG以及变性IgG的50 kD重链。如果一抗蛋白靶标在~50 kD处运行，这可能会干扰靶标检测。 |
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F(ab) 或 F(ab')2 特异性 二抗与一抗的 F(ab) 或 F(ab')2 部分结合，检测重链或轻链 |
F(ab)和F(ab')2 特异性二抗在蛋白质印迹法中并不常用，因为大多数用于蛋白质印迹法的一抗都由重链和轻链组成。一抗Fc区的作用是为免疫球蛋白上的二抗结合提供额外的空间，从而实现更灵敏的靶标检测。 |
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轻链特异性 |
优点： （1）结合与重链特异性无关。二抗将与所有具有相同轻链的免疫球蛋白类别和同种型结合。 （2）当检测已知轻链组成的一抗时，可以使用Kappa链与 Lambda链特异性的二抗来获得额外的特异性。 （3）当一抗靶标在~50 kD处时，可在免疫沉淀后用于结合天然一抗IgG。轻链特异性二抗仅检测变性IgG的 25 kD 轻链，而不结合50 kD重链。 缺点： （1）通常比H+L特异性二抗灵敏度更低。 （2）在免疫沉淀后使用时，轻链特异性二抗会结合天然一抗IgG以及变性 IgG的25 kD轻链。如果一抗蛋白靶标在 ~25 kD处运行，这可能会干扰靶标检测。 |
宿主物种和二抗类型（多克隆、单克隆、重组）
多克隆、单克隆和重组二抗以及抗体片段均可用于蛋白质印迹法。
多克隆二抗是目前使用最广泛的二抗形式。它们可识别一抗上的多个表位，因此比仅识别一个表位或没有Fc区的抗体片段的单克隆抗体更灵敏。
单克隆二抗的价值在于其批次间一致性，并且在许多情况下具有广泛的特性和出版历史。
重组二抗还有其他优势。除了具有良好的特性和批次间一致性外，它们还可以在特定位点进一步修饰，以向天然免疫球蛋白添加所需特性，例如类别转换或位点特异性标记。重组抗体可以汇集起来以生成重组抗体池，例如重组多克隆一抗或超克隆重组二抗。
下表显示了多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体作为二抗的优缺点。
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多克隆 |
单克隆 |
重组 |
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定义 |
收集来自不同B细胞的二抗，这些二抗可识别同一免疫球蛋白上的多个表位。可特异性针对免疫球蛋白的任何部分，例如 Fc 或 F(ab)。最常用于生成检测 H+L链的二抗。 |
由相同B细胞克隆产生的单一抗体，可识别同一免疫球蛋白抗原上的一个表位。它们可特异性针对kappa、lambda 轻链以及同种型和亚类。 |
源自重组DNA的单一抗体。可在DNA水平上进行修饰或用于生成确定的抗体池。 |
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优点 |
灵敏度高。多克隆抗体库中的许多抗体可以与一抗上的表位结合。 |
批次间一致性。通常具有良好的表征、特定克隆的来源背景。 |
稳定、长期供应、批次间一致性。可修改为所需特性以提高性能。 |
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缺点 |
批次间差异是可能的，但通常不如一抗那么严重。 |
检测灵敏度取决于单个表位的丰度和暴露程度。细胞系漂移可能导致抗体发生细微的长期变化。 |
非常专业且依赖表位。开发时间较长。可能需要更多前期优化。通常价格较高。 |
检测方法
二抗可以与几种不同的探针或酶结合，以检测靶抗原。标记的选择取决于应用和二抗的检测方式。酶报告基因，如辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP） 是蛋白质印迹中最常用的。这些酶可以与化学发光或显色检测方法一起使用。荧光标记的二抗也越来越广泛地用于检测低丰度靶标，信噪比也越来越高。
交叉吸附抗体
进行多重蛋白质印迹分析时，请考虑使用高度交叉吸附的二抗来限制抗体之间的交叉反应。交叉吸附是一种纯化过程，有助于消除抗体混合物中的非特异性抗体，例如特定类别、同种型或宿主物种的抗体。
免疫沉淀后WB分析
在免疫沉淀后进行蛋白质印迹分析时，二抗选择起着重要作用。进行免疫沉淀时，一抗或对照IgG通常与目标蛋白一起洗脱。因此，用于蛋白质印迹分析的洗脱部分始终含有不同量的IgG。例如，如果使用兔多克隆抗体通过免疫沉淀富集目标蛋白，则当使用传统的HRP偶联抗兔 IgG（H+L）二抗时，洗脱部分中还原和变性的重链和轻链将在25和50 kD处产生条带，因为二抗直接与变性的IgG结合。
如果二抗产生的重链和轻链不会干扰一抗的目标靶标，则只需将这些条带标记为重链和轻链。然而，当目标靶标可能在约25或50 kD处运行时，可能无法将目标条带与重链或轻链条带区分开来。
有几种可以采用的解决方案：
•使用Clean-Blot IP检测试剂，该试剂仅检测天然一抗，而不检测免疫沉淀洗脱级分中的变性IgG。
•如果目标靶点为~25 kD（轻链干扰），则使用Fc特异性二抗。
•如果目标蛋白分子量约为50 kD（重链干扰），则使用轻链特异性二抗。
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